动物宰后缺氧缺血状态激活了细胞凋亡酶，在诱导细胞凋亡的同时，还诱导了热休克蛋白（HSPs）的合成，HSPs主要功能是作为分子伴侣与抗凋亡因子，通过阻止宰后肌肉成熟过程中的细胞凋亡、蛋白降解等对肌肉结构发挥防护作用。诸多研究表明，HSPs作为生物标记物在预测嫩度、肉色、保水性方面具有一定潜力。HSP70家族是HSPs最重要的亚族之一，热休克蛋白A6(HSPA6)是其家族成员之一，在活体细胞中的各个部分组成性地表达，其功能发挥对与ATP结合、ATP-ADP转化或HSPA6磷酸化诱发构象变化具有依赖性。 白质组学是研究特定状态或时期下组织或细胞全部蛋白质水平变化。目前，蛋白质组学方法在肉品质变化机制研究方面已有较为广泛的应用。宁夏大学马旭华、李亚蕾*、罗瑞明等以宰后4 ℃条件下秦川牛背最长肌为研究对象，测定其能量水平变化和肉品质变化，采用4D-非标记定量(4D-LFQ)技术分析不同贮藏期牛肉蛋白质水平变化，结合基因本体注释（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，从分子层面明确HSPA6参与调控的通路，研究HSPA6影响能量代谢的途径，为后续从HSPA6变化角度阐明宰后肌肉组织能量代谢和品质变化机制提供参考。1 宰后牛肉贮藏过程中品质的变化11.1 HSP70家族成员筛选及其表达量变化采用4D-LFQ蛋白质组学技术研究秦川牛宰后蛋白质组的丰富度变化，利用Maxquant（v1.6.6.0）软件对所得的蛋白质二级结构进行质谱检索，共鉴定出1 149 个蛋白质，通过逐一搜索，仅筛选出HSP70家族成员HSPA6，其表达量变化情况如表1所示。HSPA6表达量在宰后0 d最大（1.51），随贮藏时间延长呈显著下降趋势（P＜0.05）。宰后初期由于动物缺血缺氧引起应激反应，HSPA6作为应激分子迅速被合成，因此0 d时其表达量较高，随成熟时间延长，蛋白质降解程度加剧，使其表达量显著降低。0～4 d其表达量降幅较低。1.2 能量代谢基本物质ATP、ADP、AMP、NADH含量的变化采用HPLC法检测宰后秦川牛背最长肌能量代谢基本物质含量，结果如表2所示。随着贮藏时间的延长，ATP含量呈显著下降趋势（P＜0.05），由0 d时的9.63 μmol/g下降至8 d时0.50 μmol/g，0～2 d期间下降速率较快，2～8 d降幅较缓，8 d时基本检测不出ATP。ADP、AMP的含量在整个成熟期（0～8 d）均呈显著下降趋势。结果表明，宰后由于有氧代谢逐渐减弱，组织中ATP迅速发生降解，促使糖酵解被激活，同时引起AMP、ADP含量下降。贮藏过程中NADH含量变化可反映组织细胞中氧化还原和能量变化状态。0～8 d期间NADH含量逐渐降低。1.3 剪切力的变化宰后成熟期间秦川牛背最长肌剪切力变化趋势如表3所示。牛肉贮藏0 d时剪切力为121.67 N，0～4 d期间显著上升，4 d达到其最大值（155.03 N），4～8 d呈显著下降趋势，8 d时剪切力为94.3 N。剪切力变化趋势表明，宰后初期秦川牛肉嫩度较差，秦川牛肉剪切力变化分析结果表明宰后成熟有助于改善肉品嫩度，适度条件的成熟有助于改善肉品嫩度是因为宰后内源酶被激活，有效加速细胞骨架蛋白的降解。1.4 MFI的变化如表3所示，MFI随成熟时间延长呈显著上升趋势（P＜0.05），贮藏0 d时MFI为30.30，8 d时达到整个贮藏过程的最高值（99.00），与0 d时相比增长了226.73%。MFI变化趋势表明，随着贮藏时间的延长，秦川牛肌肉结构蛋白的水解程度加剧，肌肉结构蛋白质在内源酶的作用下被降解为片段。1.5 离心损失率的变化如表3所示，宰后0～4 d时牛肉的离心损失率显著升高，4 d时达到最大值，4～8 d显著降低。表明4 d时牛肉中肌浆蛋白凝结到肌原纤维上，蛋白质溶解度下降，造成了水分的流失，离心损失率达到最大，保水性最差。1.6 HSPA6表达量与能量物质及品质指标的相关分析为探究宰后成熟期间秦川牛背最长肌中HSPA6与能量物质及肉品质的关系，对HSPA6表达量与能量基本物质及品质指标进行Pearson相关性分析。由表4可知，宰后成熟期间秦川牛背最长肌中HSPA6表达量与ATP含量、ADP含量、AMP含量、NADH含量、剪切力呈显著正相关（P＜0.05），相关系数r分别为0.529、0.542、0.578、0.737、0.550；与MFI、离心损失率呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数r分别为－0.771、－0.153；与ADP、AMP含量无显著相关性。本研究中HSPA6表达量与离心损失率也呈极显著负相关（P＜0.01），二者结果一致。HSPA6作为HSP70蛋白家族成员之一，具有其家族特有的两个亚结构域：N端高度保守ATPase功能域和C端底物结合功能域，ATPase功能域具有水解ATP的活性，可以处于与ATP、ADP结合状态或者无核苷酸结合状态，C端底物结合功能域可以与未折叠多肽底物暴露在外的疏水区域结合。本研究中，宰后成熟期间秦川牛背最长肌中HSPA6表达量呈显著下降趋势，并与ATP、NADH含量呈显著正相关，结果表明HSPA6可能通过利用结构域具有ATP-ADP转换活性执行宰后成熟期间秦川牛肉中的蛋白翻译后修饰。2 蛋白质组学数据分析2设置1.3 倍为标准差异倍数，4 d与0 d、8 d与0 d、8 d与4 d相比分别鉴定出30、61、31 个差异表达蛋白质，并对3 个贮藏时间段样品的蛋白质组学结果进行蛋白质组间相关性分析，如图1所示。结果表明，贮藏时间可将样本很好地区分开，同一贮藏时间样本之间区分不明显，不同贮藏时间样本之间区分明显，表明本实验样本采集合理，蛋白质组学数据可靠，满足后续分析要求。2.1 差异蛋白质筛选通过Uniprot数据库对鉴定出的差异蛋白进行逐一搜索，通过功能特性筛选出24 种与HSPA6表达相关的差异蛋白质，并将其表达丰度与HSPA6表达量进行相关性分析，结果如表5所示。2.2 GO分析对差异蛋白质及HSPA6通过GO富集分析，通过生物过程、分子功能、细胞组分解析其功能，显著富集到9 个生物过程、8 个分子功能、8 个细胞组分，如表6所示。此类差异蛋白质能够催化复合体、蛋白质复合体、细胞骨架部分等位置发生变化，同时在细胞内具有催化、水解酶等活性，并通过与碳水化合物衍生物、嘌呤核苷三磷酸结合等分子功能，引起蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢、蛋白分解参与细胞蛋白分解等生物过程。2.3 KEGG通路分析对差异蛋白质及HSPA6进行KEGG通路富集分析，其显著注释于剪接体（bta03040）与内质网中蛋白质加工（bta04141），如表7所示。HNRNPK为异质性核蛋白K，是RNA结合蛋白。DNAJA2为细胞周期进程恢复基因2，该蛋白属于进化保守DNAJ/HSP40蛋白家族，通过刺激ATP酶活性来调节分子伴侣活性，DNAJ蛋白在体外蛋白质折叠导入中作为HSP70的辅助伴侣。剪接体是由核小RNA和蛋白质因子动态组成，可识别RNA前体并催化核糖核蛋白复合体的剪接反应。内质网中蛋白质加工过程包括蛋白质的糖基化、酰基化、羟基化等。以上结果表明，HSPA6参与了宰后成熟期间秦川牛肉中蛋白质翻译后修饰。2.4 基于蛋白质组学研究秦川牛宰后贮藏期间HSPA6及相关差异蛋白变化已知HSP70 N端ATPase功能域具有微弱的ATP水解活性和ATP合成活性，即ATP-ADP转换活性，会通过影响ATP合酶参与ATP合成与消耗从而影响机体细胞供能和耗能。HSPA6作为HSP70家族一员，缺血缺氧激活了细胞凋亡酶，同时应激诱导了HSPA6的合成，阻止宰后肌肉成熟过程中细胞凋亡，并保持或降低HSPA6对肌肉细胞蛋白质的影响。HSPA6在细胞质中可与DNAJB4、E3泛素连接酶等伴侣蛋白共同作用，同时作为维持蛋白质稳定的重要参与者，在蛋白质折叠和降解中发挥作用，控制应激状态下的蛋白质稳态。HNRNPK是与mRNA结合的主要蛋白质，可能在RNA转录激活和抑制过程中发挥作用，促进细胞糖基化，诱导细胞凋亡。HSPA6可能通过ATP-ADP转换活性的功能降低组织能量水平，并通过抗细胞结构蛋白降解最终影响秦川牛肉的肉色、嫩度及保水性。3 结 语3宰后0～8 d内，随贮藏时间的延长，秦川牛肉中HSPA6表达量持续下降，ATP、ADP、AMP、NADH含量持续下降，剪切力与离心损率失先升高后降低。利用4D-LFQ蛋白质组学分析发现，贮藏0～8 d秦川牛背最长肌所含HSPA6及相关差异蛋白质表达量发生变化，这些蛋白质位于催化复合体、蛋白质复合体、细胞骨架，通过与碳水化合物衍生物、蛋白质或嘌呤核苷三磷酸结合，参与蛋白质分解代谢，引起蛋白质降解、细胞凋亡和蛋白水解等变化，进而影响肌肉结构发生变化，导致组织能量水平降低，最终影响秦川牛肉的嫩度、MFI及保水性。本文《秦川牛宰后成熟期间热休克蛋白A6对肉品质变化的影响机制》来源于《食品科学》2023年44卷13期1-8页. 作者：马旭华，李亚蕾，罗瑞明，张杏亚. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220510-128. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家肉类加工工程技术研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，贵州大学、贵阳学院共同主办，贵州医科大学、清华大学深圳国际研究生院、河南省大鲵保护与发展协会、国家市场监管重点实验室（特殊食品监管技术）支持协办，中国食品杂志社《肉类研究》杂志、《乳业科学与技术》杂志、《Food Science of Animal Products》承办，钛和中谱检测技术（厦门）有限公司、贵州油研纯香生态粮油科技有限公司、岛津企业管理(中国)有限公司、四川安好众泰科技有限公司、贵州成义烧坊酒业股份有限公司、贵州黔醉酒业（集团）有限公司、黔东南民生食品有限公司、贵州普安红茶业（集团）有限公司等企业赞助的“2023年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”即将于2023年10月28-29日在贵州贵阳召开。